Kultivierung in Mikrotropfen: kleine Ursache, große Wirkung!

von Dr. D. Weiss, Stolberg

Die Kultivierung von Eizellen und Embryonen erfolgte früher normalerweise in vergleichsweise großen Volumina. Im Laufe der Zeit setzte sich immer mehr die Kultivierung der Zellen im Mikrotropfen durch. Die Gründe für die Kultivierung im Mikrotropfen können sehr unterschiedlich sein:

• Eizellen und Embryonen werden bei der Beurteilung unter dem Mikroskop wesentlich schneller aufgefunden
• die Einzelzellkultivierung ermöglicht die Dokumentation der Entwicklung einzelner Embryonen
• bei Kultivierung der Embryonen in Gruppen können parakrine Regulationsmechanismen positiv wirken

Bei der Kultivierung im Mikrotropfen stellt sich die Frage der optimalen Größe eines solchen Tropfens. Zum einen darf er nicht zu groß gewählt sein, da sonst die parakrinen Regulationsmechanismen nicht zur Wirkung kommen oder das Auffinden der Eizelle/des Embryos unter dem Mikroskop zu lange dauert, zum anderen darf der Tropfen aber auch nicht zu klein sein, um den Embryonen ausreichend  Medium für den Stoffwechsel zur Verfügung zu stellen.
Neben dem pH-Wert ist die Osmolalität zellphysiologisch von großer Bedeutung. Die optimale Osmolalität eines Kultivierungsmediums liegt zwischen 270-290  mOsm/kg. Die Osmolalität gibt die Anzahl der osmotisch aktiven Teilchen (z.B. Salze, Proteine, Zucker) in einer Flüssigkeit an. Wenn sich der Wassergehalt des Mediums verringert, z.B. durch Verdunstung erhöht sich die Osmolalität.
Dieser Aspekt ist bei der Präparation von Mikrotropfen nicht zu unterschätzen, wie die Untersuchungen von Swain et al. (Fertil Steril Vol. 96, Issue 4; ASRM 2010, O-107) zeigten.
Er untersuchte, welchen Einfluss die Art der Präparation der Tropfen auf die Osmolalität des Tropfens hat:

• die Größe der Mikrotropfen war 10 µl, 20 µl oder 40 µl
• die Tropfen wurden in das Schälchen gesetzt und mit Öl überschichtet (Standard) oder sie wurden nach der Überschichtung mit Öl wieder abgesaugt und durch neues, frisches Medium ersetzt (gewaschene Mikrotropfen)
• die Tropfen wurden bei Raumtemperatur oder bei 37°C vorbereitet
• die Tropfen wurden in einer Sterilwerkbank mit oder ohne Airflow angesetzt

Insgesamt ergaben sich so 24 unterschiedliche Konstellationen der Präparation der Tropfen und jede wurde dreimal durchgeführt. Die Osmolalität der Tropfen wurde nach 5 Minuten und nach 24 Stunden gemessen. Dabei er­gab sich kein signifikanter Unterschied.
Ergebnisse:

• 10 µl- und 20 µl-Tropfen wiesen im Vergleich zu 40 µl-Tropfen eine um 7,1 mOsm (p<0,001) bzw. 2,72 mOsm (p<0,04) höhere Osmolalität auf
• bei der Standard-Präparation der Tropfen kam es im Vergleich zu den gewaschenen Tropfen zu einer signifikanten Erhöhung der Osmolalität um 5,85 mOsm (p<0,0001)
• die Präparation der Tropfen bei 37°C führte im Vergleich zur Raumtemperatur zu einer Erhöhung der Osmolalität um 5,99 mOsm (p<0,0001)
• die Präparation mit oder ohne Airflow hatte dagegen keinen Einfluss auf die Osmolalität
• wurden kleine Tropfen unter Airflow, bei erhöhter Temperatur und als Standard-Präparation angesetzt, so konnte ein signifikanter Anstieg (ca.  40 mosm, p< 0,0001) der Osmolalität im Vergleich zur Osmolalität des Kontrollmediums festgestellt werden

Damit zeigen die Untersuchungen von Swain et al. (2010), dass die Präparation von Mikrotropfen einen signifikanten Einfluss auf die Osmolalität hat. Je nach Art der Präparation der Mikrotropfen besteht die Gefahr, dass der zellphysiologische Bereich (270-290  mOsm/kg) verlassen wird und die Zelle in einem hyperosmotischen Medium kultiviert wird.

Bei der Präparation von Mikrotropfen ist meiner Meinung, völlig ungeachtet von der Art der Präparation, der Faktor „Zeit“ von erheblicher Bedeutung.  Und zwar die Zeit, die vergeht, bis die Mikrotropfen mit Öl überschichtet worden sind. Sie hat einen entscheidenden Einfluss auf die verdunstungsbedingte Erhöhung der Osmolalität. Je mehr Zeit vergeht zwischen dem Setzen der Tropfen und der Überschichtung, desto mehr Wasser kann aus dem Tropfen verdunsten.
Auch wenn die von Swain et al. (2010) dargestellten Ergebnisse nur auf drei Messungen pro Präparation der Mikrotropfen beruhen und der absolute Anstieg der Osmolalität des Mediums zum Kontrollmedium nicht beschrieben wird, zeigt diese Untersuchung doch, dass die Präparation der Mikrotropfen ggf. überdacht werden sollte.

Für die tägliche Laborpraxis lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass bei der Präparation der Mikrotropfen die oben genannten Faktoren entsprechend beachtet werden sollten, insbesondere bei sehr kleinen Tropfen, um eine Erhöhung der  Osmolalität des Kultivierungsmediums zu vermeiden. Ansonsten besteht die Gefahr, dass die Osmolalität nicht mehr im zellphysiologisch optimalen Bereich ist.